小鼠调节性T细胞对骨髓间充质干细胞成骨成脂分化的影响及可能机制

【摘要】研究背景再生障碍性贫血(再障,AplasticAnemia,AA)发病机理较为复杂,近来逐渐认识到免疫机制紊乱包括T淋巴细胞活化,调节性T细胞抑制在再障发中的作用,目前其已成为再障基础研究方面一个最活跃的领域。而调节性T细胞对再障发病机制的研究尚鲜有报道。红髓脂肪化是再障特征性病理改变。对于再障骨髓中的骨髓组织减少、脂肪组织增多的原因及作用今年来逐渐成为研究热点之一。由于成骨细胞和脂肪细胞共同来源于骨髓间充质干细胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells,BMMSCs),BMMSCs作为骨髓基质细胞的起源细胞,BMMSCs及其分化成的细胞在再障发病过程中的作用逐渐引起人们的重视。目前国内外均认为骨髓间充质干细胞成骨分化与成脂分化不是彼此孤立的过程,而是存在着相互制约的平衡关系。目前该领域已成为干细胞生物学研究的热点。大量的研究证实这两种分化机制与多种生长因子、及胞内外信号通路紧密相关。成脂分化的诱导因素常常是成骨分化的抑制因素,反之亦然。如过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(Peroxisomeproliferation-activatedreceptor-gamma,PPAR-γ)是成脂分化的主要的诱导因子,同时它可以抑制细胞的成骨分化。成脂分化与成骨分化是多种信号通路间相互作用的结果,包括BMP、Wnt、Hedgehogs,Delta/jagged蛋白、FGF、IGF、以及转录因子PPAR-γ(?)Runx2等多条信号通路。目前认为在非Wnt途径中,骨形态发生蛋白(bonemorphogeneticproteins,BMPs)途径具有重要地位。BMPs是研究最早和最有潜力的诱导间充质干细胞成骨分化的细胞因子,其属于转化生长因子β(transformgrowthfactor-β,TGF-β)超家族的成员之一,BMP-2是目前研究的较多且作用明显的成骨因子。近来越来越多的研究发现,BMPs可通过MAPKs,PI3K等通路进行信号转导,这些信号转导通路不直接依赖转录因子Smad的激活,其中BMPs-MAPKs通路是通路中重要的一环。Leptin和Adiponectin是脂肪组织参与免疫调节反应的两个主要的脂肪因子。Leptin对T淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞都具有免疫调节作用。免疫细胞受到免疫刺激后,产生细胞因子(尤其是TNF-a)作用于脂肪细胞,使其分泌Leptin,从而达到使免疫信号扩大化的目的。Adiponectin是脂肪细胞表达最丰的激素。主要在天然免疫效应中发挥作用,能抑制髓单核细胞祖细胞的增殖,抑制巨噬细胞的活性。那么调节性T细胞是否可以诱导BMMSCs定向分化,分化方向,可能机制及作用。我们对此进行以下研究,以期从一个新的角度探索再生障碍性贫血的发病机制。目的(1)体外分离、培养、鉴定小鼠BMMSCs,并研究其生物学特点。(2)体外分离、纯化、鉴定小鼠调节性T细胞。(3)调节性T细胞对骨髓间充质干细胞成骨成脂分化的影响及可能机制。(4)建立免疫相关骨髓衰竭小鼠模型,输注调节性T细胞、BMMSCs,观察其对骨髓脂肪化的影响。方法(1)贴壁筛选法分离纯化BALB/c小鼠BMMSCs,胰酶消化传代,FCM鉴定细胞表型,并在特定诱导剂下诱导向脂肪细胞、成骨细胞及软骨细胞分化。(2)磁珠分选法分离纯化BALB/c小鼠脾脏调节性T细胞,用流式细胞仪鉴定其免疫表型。(3)将磁珠分选法分离纯化的BALB/c小鼠脾脏调节性T细胞与BALB/c小鼠BMMSCs共培养72小时,Real-timePCR,WesternBlot检测BMMSCs成骨分化和脂肪分化相关基因和蛋白表达的变化；共培养7天后PNPP法测定碱性磷酸酶活性并进行碱性磷酸酶染色,EL1SA法和免疫组织化学染色进行I型胶原检测；共培养14天进行油红O染色检测脂滴的形成及VonKossa染色观察钙化结节的形成。(4)应用SiRNA技术沉默BMP-2基因,p38MAPK抑制剂SB203580和ERK1/2抑制剂PD98059,PKA抑制剂H-89,Real-timePCR,WesternBlot,Elisa.免疫组化方法检测BMMSCs成骨分化和脂肪分化相关基因和蛋白表达的变化,研究BMP-2,MAPKs,cAMP-PKA通路对调节性T细胞对BMMSCs成骨作用影响。(5)C57BL/6小鼠(父本)和BALB/c小鼠(母本)杂交产生CByB6F1小鼠,将F1小鼠γ射线亚致死量照射(4.5Gy)后尾静脉注射母本淋巴细胞,建立免疫相关骨髓衰竭动物模型。比较输注BMMSCs,输注调节性T细胞,输注调节性T细胞和BMMSCs共同输注,空白对照,模型组这五组对骨髓脂肪化的影响。记录白细胞,红细胞,血小板及血红蛋白的变化,股骨切片HE染色观察模型小鼠骨髓脂肪化。结果(1)BMMSCs呈梭形、长梭形或三角形,细胞排列整齐,低倍镜下可呈旋涡状或平行状。FCM检测BMMSCs高表达CD44,CD73,CD90和CD105,低表达或不表达CD14,CD34,CD45及HLA-DR。在适当的诱导条件下,BMMSCs(?)向成骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞分化。(2)磁珠纯化分离的调节性T细胞表达CD4,CD25和Foxp3。(3)体外培养,BALB/c小鼠BMMSCs与纯化的BALB/c小鼠脾脏的调节性T细胞按1：5比例共培养72小时,调节性T细胞可以明显上调BMMSCs成骨因子(BMP-2、OSX、OCN)在基因和蛋白水平的表达,以BMP-2明显,促进碱性磷酸酶(AKP)和I型胶原的表达,促进AKP活性；减少成脂因子(Adiponectin)在基因和蛋白水平的表达；与正常淋巴细胞共培养相比可以显著减少PPAR-γ,Leptin的在基因和蛋白水平的表达；加入成骨诱导培养基后可促进钙化结节的形成,加入成脂诱导培养基后可抑制脂滴的形成。(4)应用SiRNA技术沉默BMMSCs的BMP-2基因,Real-timePCR检测发现成骨基因OCN、OSX的表达明显减少,成脂基因Adiponectin、PPAR-γ基因明显增加。WesternBlot检测蛋白表达也有近似的趋势。Treg细胞作用组p38MARK,ERK1/2的磷酸化水平增高,JNK磷酸化无明显变化,应用p38MAPK抑制剂SB203580和/或ERKl/2抑制剂PD98059,I型胶原和碱性磷酸酶的表达明显受抑,加入成骨诱导基后钙化结节形成受抑,骨桥素(OPN)、骨钙素(OCN)表达减少。Treg细胞作用组cAMP.蛋白激酶A(PKA)水平均较对照组高,应用PKA抑制剂H-89,Treg细胞促进I型胶原形成的作用被明显抑制,BLIS法和免疫组化法得到类似结果。(5)CByB6F1小鼠亚致死量照射后,骨髓衰竭为可逆性,外周血象在第10天开始恢复,约6周恢复至正常水平,而亚致死量照射后经尾静脉注射母本小鼠淋巴细胞的小鼠,外周血象降低为不可逆性,造成不可逆性免疫相关骨髓衰竭。骨髓病理学检查证实骨髓衰竭,免疫相关骨髓衰竭组小鼠髓腔空虚,脂肪组织明显增多,而正常对照组和单独照射组骨髓内均无明显脂肪组织形成。骨髓脂肪化改善效果,共同输注Treg细胞和BMMSCs组和输注BMMSCs组,与输注Treg细胞组有显著差异。结论(1)全骨髓贴壁筛选培养法可简便、高效分离、纯化BMMSCs。所获得的细胞具有BMMSCs特征性的细胞表型及向脂肪细胞、成骨细胞及软骨细胞分化能力。(2)磁珠纯化小鼠脾细胞可得到足量的符合免疫表型的Treg细胞。(3)小鼠Treg细胞能促进BMMSCs成骨相关基因(BMP-2,OCN,OSX)的表达,抑制成脂相关基因(adiponectin,PPAR-γ,Leptin)的表达。(4)小鼠Treg细胞通过BMP-MARKs途径,cAMP-PKA途径促使BMMSCs向成骨方向定向分化。(5)CByB6F1小鼠在亚致死量照射后,骨髓衰竭为可逆性,经尾静脉注射母本小鼠淋巴细胞可诱导不可逆性骨髓衰竭,形成免疫相关骨髓衰竭动物模型,模型动物骨髓脂肪组织明显增多,BMMSCs增殖能力降低,不能传代。经输注BMMSCs,骨髓脂肪化较对照组有显著改善,且共同输注Treg细胞和BMMSCs组效果更为明显。
【作者】丁天凌；
【导师】谢毅；
【作者基本信息】复旦大学，内科学，2013，博士
【关键词】骨髓间充质干细胞；Treg细胞；成骨分化；成脂分化；再生障碍性贫血；

【参考文献】
[1]王慧.江西省民办高校的招生现状与对策研究[D].江西农业大学,职业技术教育学,2012,硕士.
[2]魏建新,狄帮让.起伏地表地震物理模型测试技术[J].石油地球物理勘探,2006,06:619-624+607-608+725.
[3]张志华,张志兵,肖慈珣.一种自构神经网络及其在测井资料解释中的应用[J].石油地球物理勘探,1997,03:418-427+462.
[4]犹成侠.WTO透明度原则在争端解决中的适用和发展[D].重庆大学,国际法学,2014,硕士.
[5]高立波,张强,李俊漾,海振银,徐宏妍,薛晨阳.不同形貌四氧化三钴可控合成进展研究[J].化工新型材料,2014,01:169-171.
[6]王晨.和县人才资源开发研究[D].安徽大学,行政管理,2014,硕士.
[7]王飞飞.不法公职人员下游资产处置的实证研究[D].山西师范大学,行政管理,2013,硕士.
[8]鲁晓光.船舶流体动力系数计算的TASAI方法与计算机实现[D].天津大学,船舶与海洋结构物设计制造,2004,硕士.
[9]傅广港.静电纺丝法构建碳系导电网络骨架及其超级电容器性能[D].西南交通大学,电气工程,2013,硕士.
[10]赵婷.论现实主义视域中的刘醒龙小说创作[D].湖北大学,文艺学,2012,硕士.
[11]姜玮,许新宇,姜圣华,宋勇祥.基于交叉DEA的河西地区农业经济效率研究[J].资源开发与市场,2015,04:423-426.
[12]衣萍.小学体验式习作教学策略研究[D].东北师范大学,教育,2012,硕士.
[13]王晶.Android图形绘制在汽车实时信息展示系统中的研究[D].中山大学,软件工程,2014,硕士.
[14]王国栋.骶前蝶形接骨板的设计研制与生物力学研究及有限元分析和临床对比研究[D].山东大学,外科学,2014,博士.
[15]袁飞.票据行为形式要件研究[D].华东政法学院,法律,2004,硕士.
[16]刘洢菡.《木乃伊》系列电影的文化解读[D].重庆大学,戏剧与影视学,2014,硕士.
[17]封笑.呈现内心真实的始末[D].西安美术学院,美术学,2014,硕士.
[18]李晶.武陵源核心景区旅游业扩容提质研究[D].湖南师范大学,人文地理学,2014,硕士.
[19]罗璇.B2C电子商务下物流模式及运营机制研究[D].贵州财经大学,企业管理,2013,硕士.
[20]冯其.α-螺旋抗菌肽与传统抗生素的体内和体外的协同抗菌作用研究[D].吉林大学,生物工程,2014,硕士.
[21]于彦华.基于视觉导航的两轮自平衡智能模型车的设计与实现[D].长安大学,车辆工程（专业学位）,2014,硕士.
[22]张承慧,谭震宇.分解法求解非线性系统状态方程及其应用[J].控制与决策,1997,05:618-621.
[23]王怀中.深圳国宝造币有限公司竞争战略研究[D].大连理工大学,工商管理（专业学位）,2012,硕士.
[24]戴晨曦.制约中国红十字会自然灾害救助功能的因素分析[D].南京师范大学,社会保障,2012,硕士.
[25]肖敦宇.山地城市河流健康的景观适宜度评价研究[D].重庆大学,市政工程,2014,硕士.
[26]申一頔.电信行业客户关系管理的数据仓库系统建设[J].哈尔滨师范大学自然科学学报,2005,03:53-57+63.
[27]卓越,王红,吴秋峰,朱善君,张佐.群决策支持系统中的一致性分析技术[J].控制与决策,1999,06:636-641.
[28]林山驰.HJ公司发展战略研究[D].华南理工大学,高级管理人员工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[29]高瑜.有关循环矩阵的若干问题[D].宁波大学,基础数学,2013,硕士.
[30]陈惠敏,高群,金佐尧.南翔自动化驼峰设备的开发与维修管理[J].铁道通信信号.2001(02)
[31]逯铮.中高职旅游专业课程衔接研究[D].河北师范大学,职业技术教育学,2012,硕士.
[32]赵丹.在线肺癌病例数据库的构建和初步应用[D].第二军医大学,内科学（专业学位）,2013,硕士.
[33]孟玉静.我国新型农业经营体系构建路径研究[D].西南财经大学,产业经济学,2014,博士.
[34]李竹行.基于DEA的汽车整车物流成本控制研究[D].北京交通大学,物流工程（专业学位）,2013,硕士.
[35]张尉.模糊神经控制算法在永磁同步电机控制中的应用研究[D].武汉理工大学,控制理论与控制工程,2004,硕士.
[36]郑富元.具有多重氢键形成位点的功能化聚硅氧烷的制备、表征及性能研究[D].山东大学,高分子化学与物理,2013,硕士.
[37]许广敏.老年人教育参与障碍之研究[D].华东师范大学,成人教育学,2004,硕士.
[38]李瑞琳.对手风琴改编曲《彼得鲁什卡》第四幕的研究[D].天津音乐学院,音乐表演,2014,硕士.
[39]李思超.级配碎石shakedown行为的颗粒流数值模拟[D].长安大学,道路与铁道工程,2013,硕士.
[40]胡彪.级联多电平光伏并网逆变器功率分配策略的研究[D].哈尔滨工业大学,电气工程,2013,硕士.
[41]顾祖同,李莹.MAX1000分散控制系统及其在浮法玻璃生产中的应用[J].机电一体化.1997(02)
[42]翟啸林.我国企业社会责任立法问题研究[D].曲阜师范大学,马克思主义基本原理,2013,硕士.
[43]刘翔,王文龙,曹萍,韩頔,王欢.SL150在热连轧中的应用[J].电气传动,2014,12:73-78.
[44]孙玲玲.图文式临床护理路径在乳腺癌患者中的应用与研究[D].广西医科大学,护理学,2013,硕士.
[45]曾晨杰.大型溞NAGase多克隆抗体检测水生节肢动物丰度的适用性研究[D].浙江大学,植物保护（专业学位）,2013,硕士.
[46]黄琳智.进口贸易商品结构与经济增长[D].浙江大学,2013.
[47]王之虎.甘肃省艾滋病防治策略研究[D].兰州大学,公共管理（专业学位）,2013,硕士.
[48]李春江.基于GATF的柔性版印刷质量控制方法应用研究[D].曲阜师范大学,教育技术学,2013,硕士.
[49]付伟丽.滑行式刨煤机刨头随机刨削载荷谱研究[D].辽宁工程技术大学,机械设计及理论,2012,硕士.
[50]李长仔.病毒相关性肝细胞癌根治性治疗后辅助干扰素治疗的Meta分析[D].广西医科大学,肿瘤学（专业学位）,2013,硕士.